Biobanco de parasitología de Chagas (Sangre) del Instituto Nacional de Salud

Clasificación clínica. Fase aguda: Se definió como caso sospechoso a un individuo con > 7 días de fiebre acompañada o no de hepatomegalia o esplenomegalia. El paciente fue considerado con enfermedad de Chagas aguda si además de los síntomas daba positivo por pruebas parasitológicas (Strout, micro-strout, gota gruesa de sangre o hemocultivo) o presentaba resultados positivos a dos pruebas serológicas en el transcurso de las siguientes semanas. Los pacientes fueron clasificados como negativos a la enfermedad de Chagas por lo demás señalado.

Fase crónica: Individuos sin criterios de fase aguda pero con sospecha clínica o epidemiológica de enfermedad de Chagas. Los pacientes fueron confirmados como positivos T.cruzi, al dar positivo en dos pruebas serológicas (IFA, ELISA y/o HAI). Luego se clasificó como crónica indeterminada (cuando no se evidenciaron signos o síntomas de complicaciones cardíacas) o crónica determinada de otra manera.

Pruebas de laboratorio. Métodos parasitológicos. Los métodos parasitológicos directos se realizaron (Strout, micro-strout, gota gruesa de sangre o hemocultivo) de acuerdo con la metodología descrita por Freilij et al., 1983. Los resultados se consideraron positivos cuando la morfología compatible con la T . cruzi fue observado. Todas las muestras fueron analizadas sin conocimiento del estado clínico u otra prueba.

Pruebas serológicas: El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el ensayo de anticuerpos de inmunofluorescencia (IFA) o el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) se estandarizaron originalmente en el Instituto Nacional de Salud con T.cruzi cepas pertenecientes a TcI. Todas las pruebas serológicas se realizaron por duplicado y se utilizaron controles positivos y negativos para cada ensayo. La prueba ELISA se consideró positiva cuando la absorbancia fue ≥0,300, IFA cuando los títulos fueron ≥1/32 y HAI cuando los títulos fueron ≥1/32.). Todas las muestras fueron analizadas sin conocimiento del estado clínico u otras pruebas. Los resultados indeterminados en las pruebas de serología (ELISA e IFI) se resolvieron mediante el uso de la prueba HAI.

Pruebas de diagnóstico molecular. Se recolectaron 10 ml de muestras de sangre y se almacenaron con un volumen igual de clorhidrato de guanidina 6M, tampón EDTA 0,2 M, pH 8,00 (GEB) y posteriormente se almacenaron a 8 °C. Se congelaron 5 ml de suero a -70 °C. Se emplearon alícuotas de 300 microlitros de GEB y se añadieron 5 microlitros de plásmido IAC (40 pg/microlitros) como control interno. Las muestras se sometieron a extracción de ADN utilizando el kit High Pure PCR Template Roche según Duffy et al., 2013. PCR convencional (cPCR) y PCR cuantitativa multiplex (qPCR) para la detección de ADN satélite de T.cruzi y el ADN del plásmido IAC. La prueba qPCR se consideró positiva cuando la amplificación superó el umbral de fluorescencia 0,01 y cPCR cuando se observó un fragmento de ADN de 166 pb en la electroforesis. Las muestras positivas para PCR nuclear satelital (qPCR y cPCR), fueron confirmadas por kPCR. Las cargas parasitarias por qPCR se midieron como equivalentes de parásitos por ml según Moreira et al., 2013, utilizando una cepa TcI como curva estándar (MHOM/CO/01/DA]. Todas las muestras se analizaron sin conocimiento del estado clínico u otras pruebas.

Discriminación de DTU. La PCR se realizó utilizando cinco marcadores moleculares diferentes destinados a detectar las seis DTU y las dos subdivisiones de TcI descritas previamente por otros autores (TcIDom y TcI sylvatic).